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植物抗冻蛋白在基因改造生物的应用(Antifreeze Pr


2020-07-18


植物的生产力受到各种环境压力(stress)的影响,例如冻害(freezing)、乾旱(drought)、淹水(flooding)等,而要忍受这些环境压力,有效的方法便是将保护性的蛋白或酵素利用基因转殖的方式转入植物的细胞中,利用基因工程的方法增强植物的耐受性(tolerance)。

欲将抵抗环境压力的蛋白转殖入原本无法忍受的植物体内,共可分为六个步骤:(1)找寻生存于极端压力环境下的生物,(2)了解此生物抵抗环境压力的机制,(3)将特定的基因选殖(clone)出来,(4)利用原生生物的模式(prokaryotic model)确定其基因所转录出的蛋白质产物,(5)将基因插入植物的系统并给予其压力,测试其作用能力,(6)将基因转殖入非耐受性植物中,作田野测试。而依赖此套基本模式,目前已经在其他生物中找到数种抗冻基因(antifreezing gene),例如目前已发现可由E. coli中选殖出BetA,殖入马铃薯内,以及由比目鱼(winter flounder)内选殖出AFP,转殖入烟草中,都有抗冻的效果。以下针对抗低温压力相关的基因转殖种类讨论

1.抗冷基因(antichilling gene)
对于原本生长在温暖环境的植物而言,抗冷(antichilling)的作用相当重要,因为当温度下降时会阻碍膜的流动性(flexibility);而在增加双层膜的流动性方面,因为生物膜上的非饱和性脂肪酸与植物的耐冷性有关,若是脂肪酸上具有cis-双键,可以降低脂质由液态转变成固态的中间态温度(transition temperature),约降低到0℃。因此耐冷性植物细胞膜在低温时脂质也不会凝固,细胞可维持正常活性。目前也有许多抗冷基因被发现且殖入植物,例如Des9,一个广专一性的△9-去饱和基因,由一种蓝绿藻中选殖出,且已经成功转殖入烟草植株中,可造成烟草的不饱和脂肪酸提高17倍,而将此基因转殖植株放入1℃的环境,也不会产生叶片萎黄(chlorosis)的现象。

2.抗冻基因(antifreezing gene)
抗冻蛋白(AFPs)可以调控冰的生长,会在一个特定的温度内维持冰晶的稳定,而会抑制冰的再结晶,AFPs可在许多生物体内发现,例如细菌、真菌、植物、无脊椎动物与鱼类,而且在这些生物体内还可形成多种抗冻蛋白。ATPs会限制冰晶生长,且会抑制水分子外接上微小冰晶,此过程称为抑制吸附作用(adsorption-inhibition);冰的再结晶(recrystallization)会使小的冰晶增大,而大的冰晶会造成细胞组织的物理性破坏,而因为ATPs会吸附在冰晶的面上,影响其之后冰晶的形成,而此过程会使得自由能的升高,不趋向形成冰晶的过程,因此会降低凝固点,达到抗冻的功能,而形成超冷现象(supercooling)。
根据实验发现,AFPs在可耐寒植物体内扮演的角色并非阻止细胞外冰的生成,而是限制冰晶的继续增大,因此AFPs的重要任务是减低冰晶造成的物理性伤害。若AFPs出现在细胞膜表面,便可阻止细胞原生质体的冰冻,尤其是对低温敏感(sensitive)的、含有许多水分的组织。另外,AFPs还可使细胞膜外的冰晶维持小型的状态,因为AFPs会抑制冰晶的再结晶现象。

抗冻蛋白或抗冻糖蛋白溶液的冰晶生长温度低于其熔点温度,这种冰晶的熔点与冰晶生长点之差称之为热滞(thermal hysteresis)。这种效应是一种非依数性(non-colligative)效应。若考虑抗冻蛋白与冰晶表面的相互作用特点,用吸附反应动力学的角度讨论了抗冻蛋白的抗冻活性讨论结果如下。

(1)抗冻蛋白分子和溶剂分子分别与冰晶表面的相互作用是一种可逆吸附过程,并且一个抗冻蛋白分子在吸附过程中占据n个吸附中心。
(2)抗冻蛋白溶液的热滞效应是一种合作效应,n个抗冻蛋白分子同时与冰晶表面的相互作用是一种可逆吸附过程。
(3)因为抗冻蛋白的抗冻活性是由于热滞蛋白吸附到冰晶表面,从而阻止冰晶的生长。所以,我们可以定义抗冻蛋白在冰晶表面的覆盖度为:xt=ΔT/ΔTm。其中ΔT是由于抗冻蛋白分子引起的熔点与冰晶生长点之差,即抗冻活性,ΔTm是最大的抗冻活性。
(4)抗冻蛋白分子的抗冻活性与抗冻蛋白溶液浓度的定量关係的理论计算结果与实验结果符合。
(5)对于分子量较大的抗冻蛋白,例如Type II AFPs,其一个分子在冰晶表面的吸附中心数与蛋白的合作数几乎相等;对于分子量较小的抗冻蛋白,例如Type I AFPs,其蛋白的合作数要大于一个蛋白分子在冰晶表面的吸附中心数,说明大分子量的抗冻蛋白具有较多的吸附中心。对于分子量较小的抗冻蛋白分子溶液,即使浓度相同,温度较低时的抗冻活性要低于温度较高的抗冻活性,要求的抗冻蛋白合作数也增加。因此,当浓度较低时它们将失活去活性。随着浓度的增加,各种抗冻蛋白的活性都将达到饱和。分子量较大的抗冻蛋白的吸附常数Kt远大于分子量较小的抗冻蛋白的吸附常数,说明大分子量的抗冻蛋白具有较强的与冰晶表面结合的能力。

部分植物、昆虫、鱼类因为生活于极寒冷的环境,故会产生抗冻蛋白(antifreeze proteins;AFPs)或抗冻糖蛋白(antifreeze glycoproteins;AFGPs)以保护组织。抗冻蛋白可以分为三类,Type I AFPs主要含有alanine,由α-螺旋组成的蛋白;Type II AFPs 主要是由cysteine所组成的球状蛋白;Type III AFPs 是小型的球状蛋白。此三类蛋白皆可藉由氢键键结于冰晶的特定平面上形成冰-蛋白质複合物,影响冰晶堆积的角度而影响冰晶再结晶的过程。以第一型抗冻蛋白(AFPs)为例:此抗冻蛋白发现于极地的鱼体内,含有11个胺基酸的单位形成α-helical次级构造,AFPs具有独特的功能,可以中和冰的晶核(nucleators),并且抑制其再结晶。目前,此套机制已在烟草中实行,可以抑制水的再结晶。另有实验将Type I AFP从比目鱼的体内取出,加到bromegrass的细胞悬浮培养液中,便可以明显减缓其冰冻的速率,且其产生的冰晶数量也比控制组少很多。

未来展望
植物比动物更早登陆,演化的时间也远比动物为长,因此在植物体内抵抗环境压力的机制其实相当健全,除了以上所整理的资料以外,世界上的植物生理学家仍然在植物环境逆境的领域中研究,而资料中也时常出现「详细调控机制不明」,因此应该还有很大的研究空间。而之后的主题提及基因转殖的技术,其实也与现在很热门的G.M.O.有关,现在很多马铃薯的品种中都已经添加鱼的抗冻基因;而这是解决某些地区粮食问题的一个方法,尤其是马铃薯这类的主食经过基因改良,便可以多一个耕种期,在低温时也可生长,若是经济状况较差的国家,其起码的食物来源便不虞匮乏了。若将抗冻基因转殖到食用牲畜中中,当其肉品放入冰箱冷藏时便不会产生冰晶,影响口感。可见基因转殖的技术对于人类生活的改善是很有助益,值得继续研究。


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